多联吡啶螯合物反相高效液相色谱法分离测定铜(Ⅱ)、钴(Ⅱ)、汞(Ⅱ)

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多联吡啶螯合物反相高效液相色谱法分离测定铜(Ⅱ)、钴(Ⅱ)、汞(Ⅱ)

　　螯合物的稳定常数都非常高,许多螯合反应都是定量进行的,可以用来滴定。使用螯合物还可以掩蔽金属离子。下面是小编收集整理的多联吡啶螯合物反相高效液相色谱法分离测定铜(Ⅱ)、钴(Ⅱ)、汞(Ⅱ)，欢迎阅读与收藏。

　　（一）基体

　　亲和色谱中使用的基体材料可分为天然有机高聚物、合成有机聚合物和无机载体材料三类。此外基体在偶联间隔臂之前还需进行活化预处理。

　　作为亲和色谱的基体材料应具备以下条件：

　　①具有一定的刚性、挠性和机械强度；

　　②具有在一定,5值范围的化学稳定性，不溶于普通试剂；

　　③表面具有一定的活性官能团，如羟基、胺基、醚基等，可被适当的试剂活化。

　　当使用基体材料时，还应了解它们的基本物理性质，如粒度、表面积、相对密度、孔径和孔容等必要的参数。

　　1.基体的分类

　　（1）天然有机高聚物

　　亲和色谱早期使用的基体材料主要是由天然有机高聚物制成的软质凝胶，具有三维晶格结构或多孔网络结构，凝胶内未被骨架占据的空间含有截留的液体，使其保持柔软。凝胶颗粒呈均匀的球形，具有一定的机械强度，并具有化学惰性，常用的凝胶材料为：

　　①葡聚糖（Dextran）它是由葡萄糖分子以α-1,6键相连、具有空间网状结构的聚合物，分子量大于)+。市售SephadexG(Pharmacia，瑞典），是由精制葡萄糖与交联剂环氧氯丙烷交联共聚制得的球状聚合物。0值表示不同的交联度，G值愈大，孔径愈大，G后边的数字还表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍，如0—56表示每克干胶可吸附水2.5g。SephadexG型的物理性质和应用范围见表6-2-2，其中,SephadexG-200是理想的适用于分离细胞组织的亲和色谱基体。SephadexG可耐受110℃高温和0.5mol/LNaOH溶液处理，其骨架上众多的羟基可以活化用于偶联其他化合物。

　　葡聚糖①和Sephadex②的化学结构如下：

　　①琼脂糖（Agarose）它是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖交替连接的链状多糖，糖链间通过氢键形成稳定的多糖螺旋束网状结构，其化学结构如下：

　　琼脂糖凝胶是亲水、疏松的，分子量超过78+的生物大分子可自由进出凝胶颗粒。它具有良好的化学惰性，可在0-40℃和pH=4-9的条件下使用，不发生离子交换，对生物大分子仅产生很低的特异性吸附。它的机械强度高于葡聚糖，分离蛋白质的分子量范围可达10^8。

　　琼脂糖凝胶的不足之处是它不宜干燥和反复膨胀使用，若长期保存应添加无害的抑菌剂（0.2%叠氮钠、甲苯），并在8℃以下不结冰的环境下保存，若冰冻会导至凝胶球的结构产生不可逆的破坏。

　　琼脂糖凝胶的商品型号为Sepharose（Pharmacia，瑞典）和BioGelA（Bio-Rad，美国），近来使用2，3)二溴丙醇作交联剂制得的SepharoseCL（Pharmacia，瑞典）可经受110-120℃高压灭菌处理，在pH-3-4介质中使用，其稳定性大大提高，可用含高浓度脲、盐酸胍、有机溶剂和非离子型表面活性剂的流动相进行洗脱。常用的琼脂糖商品性能及应用范围见表6-2-3。最新报道的将琼脂糖先与含多环氧基长链交联剂（如聚乙二醇）进行交联，然后再用短链交联剂（如2，3-二溴丙醇）进行第二次交联，可制得凝胶商品为Superose,，它的机械强度和化学稳定性进一步提高，当用0.1mol/LHCL及0.1mol/LNOaoh在40℃处理14天后，色谱性能无明显改变，并能承受70%甲酸及30%乙腈的处理，它可作为高效液相亲和色谱的基体材料。

　　表6-2-3琼脂糖商品性能及应用范围(略）

　　（2）合成有机高聚物

　　在亲和色谱中使用的合成有机高聚物，其表面应具有亲水性，且粒度均匀，具有多孔或非多孔结构，可分为以下几种类型的高聚物。

　　①聚丙烯酰胺及其衍生物聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺、交联剂N，N-亚甲基二丙烯酰胺，在引发剂N，N，N，N-四甲基乙二胺和过硫酸铵存在下聚合而成，它为具有网状结构的凝胶，其制备反应如下：

　　常用商品型号为BioGelP（Bio-Rad，美）软质球形凝胶，其中P表示交联度，P值愈大表示交联度高，其孔径也愈大。它可在pH=2-10的介质中使用，有较好的化学稳定性，其主要优点是具有大量可修饰的酰胺官能团，可用多种方法进行偶联反应；不足之处在于机械强度较差，网孔小，不宜用作生物大分子的分离。表6-2-4为Bio-GelP型商品的主要性能和应用范围。

　　聚丙烯酰胺——琼脂糖共聚物Utroggel（LKB/，瑞典）是一种新型聚合物，它具有聚丙烯酰胺的三维晶格，其空隙内又含有琼脂糖凝胶，并具有可功能化的酰胺基和羟基，粒度为60-140μm，机械性能较强，比常用的凝胶基体耐压，可在较高流速下操作，表6-2-5列出Utroggel的技术规格。

　　由N，N-亚甲基二丙烯酰胺与丙烯基葡聚糖共聚生成的Sephacryl（Phamarcia，瑞典）硬质凝胶，粒度25-75μm，可在pH=3-11介质中使用，于120℃、pH=7的环境中消毒。它用0.2mol/LNaOH室温处理100h，凝胶的多孔性和流速无变化，并可用含6mol/L盐酸胍和十二烷基磺酸钠（SDS）的流动相进行洗脱，Sephacryl-2-6系列性质见表6。

　　以N-丙烯酰基-2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇为单体，以N，N-二乙烯基酒石酸二酰胺为交联剂，聚合生产的Trisacryl（IBFBiotechnics,法）凝胶，具有良好的亲水性、低的非特异性吸附，良好的机械性能和化学稳定性，可在pH=1-11介质中使用，可耐受变性剂和有机溶剂，并具有抵抗微生物侵蚀能力，其骨架主链上的羟甲基官能团可用多种方法活化，它对配位体蛋白质的键合容量高于琼脂糖基体，现已获愈来愈广泛的应用。

　　②甲基丙烯酸酯共聚物聚甲基丙烯酸羟乙酯是由单体甲基丙烯酸-2-羟基乙酯（HEMA）与交联剂二甲基丙烯酸-1,2-亚乙基酯（EDMA）共聚生成的、具有刚性网状结构的疏水球状颗粒，粒径10μm，有良好的机械强度和化学稳定性，在pH=2-13介质中使用，可耐2mol/LHCL或NaOH清洗，加热至170℃进行高压灭菌而不分解，它富含羟基可用多种方法活化，可作为高效液相色谱固定相使用。另一种聚甲基丙烯酸缩水甘油酯是甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、季戊四醇二甲基丙烯酸酯（PDMA）和聚乙二醇（PEG）三者的共聚物，具有良好的机械强度和化学稳定性，粒径10μm，可在pH=2-12介质中使用，可耐受脲、盐酸胍、有机溶剂的处理，此凝胶富含醇羟基和醚基，可用多种方法活化，常用于高效亲和色谱的是TSKToyopear(ToyoSodaCorporation，日）HW-65F凝胶。

　　③脲醛树脂在1，2-丙二醇介质中，尿素与甲醛在硝酸铁催化剂存在下，40℃行缩聚反应4h，可制得单分散非多孔微球，粒径约2-4μm，可在pH=1-13介质中使用，显示良好的机械强度和化学稳定性，脲醛树脂微球表面的酰胺基团可用多种方法活化，已作为高效亲和色谱固定相的基体。

　　④高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物交联度达40%-90%的苯乙烯——二乙烯基苯共聚制得的全多孔微球，粒度10-40μm，孔径30-100nm，它是在80年代以后采用种子聚合法制成的新型基体材料，可在pH=1-14的介质中使用，具有良好的机械强度和化学稳定性，可直接作为高效反相色谱固定相使用，其表面呈强疏水性，可经磺化或氯甲基化反应后，偶联适当的间隔臂和配位体，并已在高效亲和色谱中获得愈来愈多的应用。

　　应当指出由高交联苯乙-二乙烯基苯共聚物制得的灌注色谱固定相——POROS（PerSptiveBiosystems，美），开辟了对生物大分子分离的新途径，它在10-20μm的球形颗粒上，制备出具有600-800nm的贯流大孔并与80-150nm的渗流小孔相沟通的特殊网络结构，可在广泛的x;值范围、低柱压下实现生物大分子的快速分离。此类填料经磺化或氯甲基化处理后，也可用于制取高效亲和色谱固定相。

　　近年还研制出高交联度苯乙烯-二乙烯基苯非多孔共聚微球，其粒径仅2-5μm，可装填于φ4.6mmx5cm的短色谱柱中，也可实现生物大分子的快速分离。

　　（3）无机载体材料

　　现在高效液相色谱中广泛采用的无机载体材料是Sio2，其中粒径5-10μm、孔径30-100nm的全多孔Sio2微球，在高效亲和色谱中使用较多，近年为实现生物大分子的快速分离，也逐渐使用2-5μm非多孔Sio2微球。

　　80年代末期不少色谱工作者已探讨使用机械强度高、在广泛pH值范围内稳定的ZrO2、Tio2、CeO2和Wo3作为高效亲和色谱的新型载体，并研制成功全多孔微球和非多孔微球的制造方法，已取得可喜的成果。

　　2.基体材料的活化——功能化反应和偶联反应

　　前述各种基体材料皆需进行活化处理后，才能与间隔臂联接，各种活化基体的方法如下：

　　（1）无机载体材料的活化

　　①活化方法以Sio2为代表的无机载体材料，经盐酸处理后，其表面含大量硅羟基，此羟基可与活化试剂——硅烷偶联剂反应，使基体功能化，而成为表面联接有反应活性官能团的活化基体。如经盐酸处理过的Sio2与γ-氨丙基三乙氧基硅烷进行的活化反应为：

　　表6-2-7常用硅烷偶联剂(略）

　　（2）合成高聚物基体的活化对聚丙烯酰胺基体可用含双官能团的活化试剂，如戊二醛、乙二胺、N-羟基丁二酰亚胺等来进行活化，活化反应如下：

　　对苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，常用氯甲基化反应、磺化反应、硝化反应进行活化，活化反应如下：

　　（3）多糖聚合物的活化

　　琼脂糖、葡聚糖均含有大量羟基，可与含亲电子基团的活化试剂，如溴化氰、环氧氯丙烷、二乙烯基砜、丁二酰氯等反应，进行活化，活化反应如下：

　　（二）间隔臂

　　在亲和色谱固定相中，需通过间隔臂将配位体联接在基体上，由于间隔臂占据一定的机动空间，当配位体与被测定的生物分子（尤其是生物大分子）产生亲和作用时，有利于克服存在的空间阻碍作用。

　　当粒度小、孔径小的基体联接小分子配位体时，或当大分子配位体比较密集地分布在基体上时，其与被测定生物分子的亲和作用，会受到空间阻碍作用的影响。为了克服空间阻碍作用，并实现配位体与被测定生物分子间最佳的相互作用，必须解决如下两个主要问题。

　　1.间隔臂长度的选择

　　关于间隔臂的长度，经过前人大量实践经验已经确定，对低亲和能力的配位体或当作用物为生物大分子（蛋白质）时，在基体和配位体之间的间隔臂长度约为2-12个原子的距离。为获得最佳的亲和作用，它们之间需插入4-6个亚甲基的桥键。对具有高亲和能力的配位体或当作用物为表观分子量低的生物分子时，对间隔臂长度的要求就不如上述系统那样严格。

　　2.用作间隔臂的化合物的选择

　　对用作间隔臂的化合物，文献上推荐使用具有NH2(CH2)nr通式的ω-氨烷基化合物。通式中R可为羧基、羟基、胺基或配位体自身。此类化合物分子中含n个亚甲基（—CH2—）疏水性基团。

　　具有疏水性基团的间隔臂分子会与配位体或作用物生物分子之间产生非特异性吸附作用，干扰配位体与生物分子间特效性的锁匙相互作用，为消除非特异性吸附，可在沿间隔臂分子的长轴方向的某些原子上偶联亚胺基（—NH2—）、羟基（—OH）等官能团，以破坏单一的疏水区域，增强亲水性。

　　显然，当使用亲水性强的间隔臂分子来代替疏水性间隔臂分子时，会显著降低对锁匙特效亲和作用的干扰。有些亲和色谱分离实例还表明，当存在少量非特异性吸附现象时，亲和色谱分离却会得到最有价值的分析结果。因此在亲和色谱分析中，仔细控制特效性亲和作用和非特异性疏水作用的平衡，会比完全消除非特异性吸附作用更有利。

　　间隔臂分子长度的选择，可依据前述惯例或依据制备的难易程度加以考虑，只要获得最佳分离效果，就不必再增加臂长。间隔臂过长，会因挠性引起折叠或缠绕，也会使能与生物分子作用的配位体密度减小，并增加非特异性吸附或降低色谱柱柱效。

　　用作间隔臂的化合物结构，与活化基体时使用的活化试剂相似，皆为含有双官能团的化合物，其分子一端与活化基体联接，另一端将与配位体偶联。

　　可作为疏水性间隔臂的有机化合物有：

　　作为亲水性间隔臂的有机化合物有：小肽类如，由两个甘氨酸和一个赖氨酸缩合的三肽，在实际使用中应根据亲和色谱分离目的的不同而恰当的采用疏水性或亲水性间隔臂。

　　（三）配位体

　　在亲和色谱固定相上键联的配位体，可为染料配位体、定位金属离子配位体、包合配合物配位体、生物特效配位体、电荷转移配位体和共价配位体，以下分别予以阐述。

　　染料配位体

　　三嗪活性染料为主要使用的染料配位体（DyeLigand），此类染料分子的结构与生物酶的天然底物相似，故可与酶或蛋白质的活性作用点结合而用于亲和色谱。

　　氯原子被取代基依次置换后，其化学活性显著下降。当反应温度为0-5℃时，第一个氯原子可被置换；当反应温度为40-50℃时，第二个氯原子可被置换；第三个氯原子需加热90℃以上才可被置换。

　　三嗪活性染料产品主要为瑞士汽巴8嘉基公司（Ciba-Geigy）生产的$-9/;<=0系列和英国帝国化学工业公司（ICI）生产的Procion系列。它们可分为三种不同类型的产品，即二氯三嗪型、一氯三嗪型和一氟三嗪型。

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